寺田屋の名を不朽のものとしたのが、慶応2年（1866年）1月23日未明に発生した「坂本龍馬襲撃事件（寺田屋遭難）」です。薩長同盟の締結を京都で成し遂げた龍馬は、盟友・三吉慎蔵とともに寺田屋の2階に宿泊していました。当時の伏見奉行所は、倒幕派の危険人物として龍馬をマークしており、数十名の捕吏を動員して建物を包囲しました。
この絶対絶命の危機を救ったのが、当時寺田屋で働いていた龍馬の妻・お龍（楢崎龍）です。1階の風呂に入っていたお龍は、窓の外の物音や気配から包囲網に気づき、着物を羽織ったまま裸足で2階へと駆け上がり、龍馬たちに急を告げました。この機転がなければ、龍馬はその場で命を落としていたに違いありません。
急襲を受けた龍馬は、高杉晋作から護身用にと贈られていたスミス＆ウェッソン社製第2型拳銃を構えて応戦。三吉慎蔵は手槍を振るって敵を防ぎました。激しい銃撃戦のなかで龍馬は両手の親指付け根などに重傷を負いながらも裏木戸から脱出、濠川沿いの材木小屋へと身を潜め、追手から逃げ切ることに成功しました。
この事件を語る上で欠かせないのが、寺田屋の六代目女将・お登勢の存在です。彼女は面倒見がよく肝の据わった女性で、幕府から追われる志士たちを匿い、物心両面で支援を惜しみませんでした。龍馬がお登勢に宛てた手紙には、深い感謝と敬意が随所に記されており、寺田屋が単なる宿泊施設を超えた「志士たちのセーフハウス」として機能していた実態を物語っています。
