ワンナイの最大の武器は、一度見たら脳裏から離れない強烈なキャラクター造形にありました。番組から生まれたワンナイキャラクター一覧を振り返ると、単なるコントの枠を超えて単独で社会現象を起こしたアイコンが多数存在します。
中でも突出した人気を誇ったのが、ゴリが演じる厚化粧のガレッジナース・ゴリエです。「ペコリ〜」「波乗りジョニー」などのフレーズとともに繰り広げられるキレのあるダンスは全国の小中高生を熱狂させました。2004年には『Mickey』でCDデビューを果たし、オリコン1位を獲得。さらに2005年の『NHK紅白歌合戦』に紅組として出場を果たすなど、コントキャラクターの枠組みを完全に突破しました。
一方、宮迫博之が演じた轟さん（轟轟太郎）も番組の屋台骨でした。全身黒ずくめにカツラ、極端に低い声で「ギューッ！」「男の中の男、出てこいや！」と叫びながら暴走する姿は、視聴者に強烈なインパクトを与えました。この轟さんは、もともと宮迫が日常の人間観察から着想を得たアドリブから誕生したとされ、ゲスト俳優やアイドルがどれだけ巻き込まれても一切ブレない圧倒的な世界観を構築していました。
さらに、山口智充が演じる「チョコボーイ山口」や、宮迫の「落武者」、川田の「ギュー太郎」など、枚挙にいとまがありません。また、宮迫と山口による音楽ユニット「くず」は、西野亮廣（キングコング）作詞・作曲の『全てが僕の力になる!』でオリコン週間チャート1位を記録するなど、笑いと本格的な音楽性を両立させた伝説の神回を数多く生み出しました。
