ドン・キホーテの代名詞とも言えるのが圧倒的な営業時間です。しかし、すべての店舗が終夜営業を行っているわけではありません。一般的な傾向として、郊外の大型店舗や繁華街の旗艦店には近くのドンキホーテ24時間営業の拠点が目立ちますが、商業施設内のテナント店舗や住宅街近隣の店舗ではドンキホーテ営業時間深夜24時や26時（翌2時）で閉店するケースも増えています。
深夜に来店する際に注意したいのが、特定コーナーの営業体制です。店舗自体は24時間オープンしていても、第1類医薬品の販売カウンターやブランド品・免税カウンター、自転車修理コーナーなどは専門スタッフの不在により深夜帯の取り扱いを休止している場合があります。深夜の急な常備薬購入などを目的とする場合は、事前に店舗へ電話確認するかフロア情報をチェックしておくと安心です。
