2000年代に入り、20代後半を迎えた山本耕史に再び巨大な波が訪れる。2004年のNHK大河ドラマ『新選組！』における土方歳三役だ。三谷幸喜脚本のもと、香取慎吾演じる近藤勇の参謀として、冷徹さと熱き友情を併せ持つ鬼の副長を完璧に演じきった。
若い頃の繊細な美しさはそのままに、年齢を重ねて身についた凛とした立ち振る舞いと眼光の鋭さ。画面に登場するだけで空気を変えるような凄みは、彼の演技者としての成熟を明確に示していた。この作品での演技が高く評価され、山本は時代劇の担い手としても確固たる地位を確立する。後に続編となる単発ドラマが作られたことからも、彼の土方歳三がいかに愛されたかが分かるだろう。
