御陵衛士の結成以降、新選組と伊東派の対立は水面下で極限まで張り詰めていました。決定打となったのは、新選組屈指の剣客でありながら御陵衛士に参加していた斎藤一の存在です。通説では、斎藤は土方歳三が放った二重スパイ（潜入密偵）であり、伊東が薩摩藩と結託して近藤勇の暗殺を企てているという極秘情報を新選組本隊へ密告したとされています。
事態を重く見た近藤と土方は、伊東の排除を決意します。これが幕末史に名高い油小路の変（あぶらのこうじのへん）の発端です。伊東甲子太郎の暗殺理由は、新選組にとって自組織の瓦解を防ぎ、近藤暗殺の芽を摘むための先制攻撃でした。
慶応3年11月15日（1867年12月10日）、近藤勇は「国事に関する重大な相談がある」と偽り、七条醒ヶ井の妾宅へ伊東を酒宴に招き寄せました。伊東の仲間たちは罠を警戒して引き留めましたが、自身の弁舌に自信を持つ伊東は護衛も連れずに単身で赴き、歓待を受けて酩酊状態で帰路につきます。
油小路木津屋橋の暗がりで待ち伏せていたのは、新選組きっての暗殺部隊でした。槍の名手・大石鍬次郎らの急襲を受け、肩口から深手を負った伊東は、即座に刀を抜いて応戦しながら「奸賊ばら！」と叫び、近隣の本光寺の門前で壮絶な絶命を遂げました。
新選組の冷酷な作戦はここで終わりませんでした。土方らは伊東の遺体を収容せず、あえて油小路の辻に囮（おとり）として放置。遺体を引き取りに駆けつけた御陵衛士の同志たちを一網打尽にする伏兵作戦を敢行したのです。罠と知りつつ遺体収容に向かった御陵衛士は多勢に無勢の奇襲を受け、二刀流の達人・服部武雄や、かつて新選組幹部であった藤堂平助、毛内有之助らが壮烈な死を遂げました。鈴木三樹三郎ら生き残ったわずかな隊士のみが、薩摩藩邸へと逃げ延びる結果となったのです。
