東京都公式発表資料によると、上野動物園の通常営業における開園時間は午前9時30分から午後17時00分までとなっています。ここで最も注意しなければならないのが、「最終入園時間」が閉園の1時間前である16時00分に設定されている点です。当日券の購入や年間パスポートの新規発行・更新も16時00分で締め切られるため、午後からの遅い来園を検討している場合は時間に余裕を持つ必要があります。
また、動物たちの健康管理や生態リズムを守るため、一部の動物は16時前後から順次寝小屋（バックヤード）へ収容されます。閉園ギリギリに入園しても、ジャイアントパンダや大型獣をはじめとする主要な展示が見られないケースが多いため、園内の魅力を満喫するには遅くとも14時30分までの入園が推奨されます。
休園日の基本ルールは毎週月曜日です。ただし、月曜日が国民の祝日や振替休日に当たる場合は開園し、その翌日（原則火曜日）が振替休園日となります。都民の日（10月1日）や開園記念日（3月20日）前後の特別開園など、一部変則的なスケジュールも存在するため、公式の開園日カレンダーを事前に確認しておくことがトラブルを防ぐ基本です。
