普段は夕方に閉鎖される園内だが、特定のシーズンには幻想的な雰囲気を楽しめる夜間開園が実施される。春の「桜まつり」や夏の「イルミナイト万博」、秋の紅葉ライトアップ期間中には、営業時間が午後9時前後まで大幅に延長されるのが通例だ。
夜間開園時には、太陽の塔が迫力あるライティングで浮かび上がり、普段とはまったく異なる表情を見せる。ただし、夜間延長営業が適用されるのは一部のエリア（自然文化園の一部や日本庭園など）に限られる場合が多く、全ての出入り口が開放されているわけではない。中央口以外のゲートが早めに閉鎖される夜もあるため、夜間イベント参加時は帰宅ルートの確保にも気を配る必要がある。
