上野鈴本演芸場を語る上で欠かせない最大のアイデンティティは、一般社団法人落語協会の専用定席として運営されている点にあります。東京には新宿末廣亭、浅草演芸ホール、池袋演芸場を含めた「都内四大定席」が存在しますが、末廣亭や浅草演芸ホールが落語協会と落語芸術協会（芸協）の興行を交互に行うのに対し、鈴本演芸場は一貫して落語協会の所属芸人のみが番組を編成しています。
寄席の公演スケジュールは、毎月1日〜10日を「上席（かみせき）」、11日〜20日を「中席（なかせき）」、21日〜月末を「下席（しもせき）」と呼ぶ10日刻みのサイクルで構成されています。毎日昼の部（開場12:00頃／開演12:30頃）と夜の部（開場17:00頃／開演17:30頃）が開催され、それぞれ最後の出番を務める看板落語家「主任（トリ）」を中心に、多彩な噺家と色物芸人が息もつかせぬリレーを繰り広げます。
番組表（タイムテーブル）の魅力は、落語だけに留まりません。漫才、紙切り、奇術（手品）、音曲、俗曲といった「色物（いろもの）」が落語と落語の合間に絶妙なタイミングで挟まれます。この緩急自在の構成こそが、4時間近い長丁場であっても観客を一切飽きさせない寄席の神髄です。さらに毎週日曜日などの午前中に開催される「早朝寄席」では、次代を担う若手「二ツ目」の真剣勝負を破格の木戸銭で鑑賞できるため、熱心な演芸通の間で根強い人気を博しています。
