観光施設の計画を立てる際、定休日の存在は見落とせない要素です。新江ノ島水族館は原則として年中無休で営業を行っており、曜日による定期的な休館日は設けられていません。
ただし、例外として年に数日間の施設点検・メンテナンス休館日が設定されます。例年、繁忙期を避けた1月下旬〜2月上旬頃に、館内設備や生命維持システムの集中保全を目的とした休館日が2〜3日程度設けられます。この期間は全館クローズとなり、敷地内への入場もできなくなります。
台風や高潮などの荒天時にも、来館者の安全確保のために臨時休館や開館時間の繰り上げ・繰り下げが発生することがあります。遠方から訪れる際は、出発前に公式サイトのトップページに掲示される「本日の営業状況」をチェックしておくのが確実です。